科研 |Nat Commun：基于组织膨胀的空间分辨蛋白质组学
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编译：微科盟-苏天行，编辑：微科盟Emma、江舜尧。
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导读空间分辨蛋白质组学是用于绘制生物样品蛋白质组异质性的新兴方法，但由于组织微量采样技术和纳米级样品体积的质谱分析的复杂性，它在技术上仍然具有挑战性。在这里，我们描述了一种基于组织膨胀与基于质谱的蛋白质组学相结合的空间分辨蛋白质组学方法，我们称之为膨胀蛋白质组学（ProteomEx）。ProteomEx能够定量分析哺乳动物组织中蛋白质组的空间变异性，横向分辨率约为160 mm，相当于0.61 nL体积的组织；且使用手动微量采样，无需定制或特殊设备。我们验证并证明了ProteomEx在生物组织(包括大脑、肝脏和乳腺癌)的流程化大规模蛋白质组学分析中的实用性。我们进一步在小鼠模型大脑亚区中应用ProteomEx，通过比较蛋白质组学分析来识别与阿尔茨海默病相关的蛋白质。
论文ID
原名：Spatially resolved proteomics via tissue expansion译名：基于组织膨胀的空间分辨蛋白质组学期刊：Nature CommunicationsIF：17.694发表时间：2022.11通讯作者：Kiryl D. Piatkevich、郭天南
通讯作者单位：西湖大学
实验设计
实验结果
为了进行生物组织的空间分辨蛋白质组学，我们采用改良的蛋白质保留的膨胀显微镜（ExM，expansion microscopy），然后进行膨胀样品的显微解剖、凝胶内消化和基于质谱（MS）的回收肽的蛋白质组学分析。为了将组织膨胀与液相色谱（LC）-MS/MS分析相结合，我们开发并优化了组织样品扩增、手动显微解剖和肽提取的关键步骤，包括：①具有增强的膨胀系数和机械稳定性的优化水凝胶；②可逆的蛋白质锚定到聚合物网络；③样品的各向同性膨胀；④样品染色；⑤样品显微解剖；⑥凝胶内消化和肽提取（关于方案开发和优化的细节，参见补充说明1，补充表1,2,3和补充图1,2）。因此，我们建立了一种通过物理样品放大来增强组织空间分辨的基于MS的蛋白质组学分析的方法，我们称之为ProteomEx。ProteomEx工作流程包括几个样品处理步骤（如图1A、B所示）。首先，用N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯处理化学固定的组织切片（如果需要可以进行免疫染色），以在蛋白质伯胺上连接丙烯酰基。因此，它们能够通过酰胺基可逆地锚定到聚合物网上。然后将处理过的样品嵌入到水凝胶中，优化的水凝胶提升了膨胀系数 (线性尺寸提升了5.5-8倍，相当于体积膨胀166-512倍，以在手动解剖时实现更高的空间精度)，并增强完全膨胀的样品的机械性能(适合处理和手动采样，避免样品开裂和破碎)。接着，对组织-水凝胶复合材料进行洗涤剂处理以使其机械均相化，这允许嵌入组织的各向同性膨胀和处于膨胀状态的蛋白质保留。接下来，为了便于组织成像和手动显微解剖，样品用比色染料（考马斯蓝）染色后，通过肉眼和简单的成像设置能够有效地观察膨胀的脑组织的形态细节（图1C-E）。然后，可以对膨胀的样品进行成像（以将蛋白质组图谱映射到组织形态上），并以约100微米的精度手动解剖感兴趣的各个区域或将组织微量采样到小体元中。使用碱性缓冲液和胰蛋白酶进行优化的凝胶内消化，并从切除组织水凝胶切片中提取肽，然后进行LC-MS/MS分析和数据处理。
2. ProteomEx的验证和表征
由于ProteomEx涉及化学处理和组织膨胀，因此量化肽提取的效率并验证该方法可实现的定性定量重复性和灵敏度非常重要。首先，我们决定测量肽产量和误切率，从而作为样品制备质量控制的主要参数。对于基准检验，我们使用了成熟的溶液内消化和压力循环技术（PCT）辅助组织消化方法，这些方法广泛用于基于MS的蛋白质组学分析中的组织处理。在我们完成本研究时，Drelich等人发表了一种概念上相似的方法，我们还将其与ProteomEx进行并排比较。由于所描述的方法基于Tillberg等人报道的原始蛋白质保留ExM方案，为方便起见，我们将其称为proExM-MS。应该注意的是，我们对Drelich等人最初描述的肽回收程序进行了一些优化，并提高了肽产量和蛋白质鉴定（补充说明2和补充图3）。采用多种方法对相邻小鼠脑组织切片进行处理，发现ProteomEx的肽提取率比溶液内消化、PCT和proExM-MS高约1.4-1.7倍；特别是ProteomEx的肽产量为72.54 ± 6.17 μg/mg（肽/组织，均值±标准差SD），高于溶液内消化（44.59 ± 18.54 μg/mg）、PCT（43.58 ± 11.59 μg/mg）、proExM-MS（50.64 ± 9.33 μg/mg）（图2A）。此外，ProteomEx的特点是误切率 (20.04 ± 1.28%)低于溶液内消化（27.96 ± 1.38%）和PCT（24.07 ± 1.22%）方案，但接近于proExM-MS（21.17 ± 5.17%）（图2B）。用ProteomEx和proExM-MS实现了更高的肽消化和提取效率，可能与膨胀状态下的分子分散有关，其为酶分子提供了更好的途径进入水解位点。这些结果表明，与用于组织样品的溶液内和PCT辅助样品制备方法以及概念上相似的proExM-MS相比，ProteomEx中使用的组织膨胀方案提供了更高的肽提取效率。
接下来，使用timsTOF Pro质谱仪以数据依赖采集（DDA）模式分析提取的肽。使用溶液内、PCT、proExM-MS和ProteomEx方法处理每个样品约200 ng的肽，我们鉴定了37173、34304、20413和30630条肽，分别对应于4199、4278、3181和3818种蛋白质（图2C、D；补充图4）。ProteomEx、proExM-MS和PCT的肽和蛋白质数量的变异性低于溶液内方法，表明这些方法的重现性更高。用ProteomEx鉴定的蛋白质数量比用溶液内和PCT方法鉴定的蛋白质少约400种蛋白质，但比proExM-MS高637种蛋白质。分析四种方法的所有鉴定蛋白质的多样性，发现有56.6%的重叠，并且每种方法独有的鉴定数低于蛋白质总数的7.0%（图2E）。鉴定蛋白质的重叠是合理的（大于50-60%是DDA模式数据分析的的典型重叠），并且足够高的重叠率表明了ProteomEx的性能与基于MS的蛋白质组学的样品处理方法相当。此外，所有四种方法通过生物标志物，亚细胞定位和生物学功能表现出相似的鉴定蛋白质分布（图2F，补充图4）。为了验证ProteomEx过程中的化学处理如何修饰氨基酸，我们检索了四种样品制备方法获得的翻译后和化学修饰的肽。数据分析显示，用ProteomEx提取的肽中只有很小一部分（<0.5%）具有与N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯（NSA）锚定相关的化学修饰，而自然的翻译后修饰肽的回收与其他方法类似（补充注释3和补充图5）。总体而言，上述结果表明，ProteomEx可以获得高质量的蛋白质组，并且蛋白质鉴定的数量和类型、翻译后修饰回收方面与其他可用方法相当，可满足蛋白质组学分析的需求。用比色染料染色膨胀组织有助于肉眼观察精细的形态特征，并可通过手工显微解剖精确定位的感兴趣区域（实际尺寸低至约100 µm）。为了验证这种方法适合于质谱分析，我们使用了一个活检穿刺器，它提供了高度重复的微量取样，切除直径3毫米的组织水凝胶复合片（相当于膨胀前直径约500 μm或5.9 nl体积的组织，这里和全文的尺寸对应于膨胀前的尺寸）和来自相同膨胀小鼠脑组织切片的相邻空白水凝胶片（用作可能的组织外肽扩散的对照），分析如上所述，且使用纯MS缓冲液作为阴性对照。我们平均每个穿刺样品鉴定了24437种肽和3541种蛋白质，这远远高于空白水凝胶（416/132种肽/蛋白质）和MS缓冲液（260/116种肽/蛋白质，对应于携带污染水平；图2C、D），以及通过亚细胞定位和生物学功能观察到的与全样品分析相似的蛋白质分布（补充图4）。为了进一步对ProteomEx进行基准检验，我们通过计算每对宏量样本(250 nL)和微量样本(2.75-17.19 nL)之间的Pearson相关性，以及每个尺寸组的变异系数(CV)值，来评估蛋白质定量的技术重复性。为了尽量减少微量样品制备的生物学变异，我们使用了比脑组织更均匀的小鼠肝组织。与其他测试方法相比，ProtemoEx方法在宏量样本蛋白质定量方面具有相当的可重复性，而在微量样本制备方面具有相似或略低的可重复性（补充图6、7）。因此，ProteomEx可以有效地从膨胀组织的小块中提取肽，具有足够的技术可重复性，并且可以忽略组织周围空白水凝胶中的肽扩散。此外，与ProteomEx处理的全脑切片相比，3毫米凝胶识别出的多肽数量略低，而蛋白质数量相当。接下来，我们使用ProteomEx方法探索了组织微量采样的体积依赖性极限。处理显微解剖的小鼠脑冠状切片，实际体积约为0.6 nL（0.2 μL组织-水凝胶复合体）、2.4 nL（0.9 μL）、5.4 nL（2.1 μL）、9.6 nL（3.8 μL）和15.0 nl（5.9 μL；相当于30 μm组织切片上横向分辨率约160、320、480、640、800 µm），我们平均每个尺寸组分别鉴定出分别对应于928、3044、4203、5058和5105种独特蛋白质的2987、15705、23898、35160和37071条肽（图2G、H）。正如预期的那样，鉴定出的肽和蛋白的数量随着组织体积的增加而增加，在组织大小为5.0 nL(或直径为480 μm)左右达到平台期。PCT辅助样品制备作为微量样本处理的代表性方法，可以在0.2-1 μL组织体积范围内有效分析，比ProteomEx高出约3个数量级。因此，ProteomEx为约100 μm横向分辨率下亚纳升体积的样品制备，提供了一种可供选择的组织蛋白质组学分析策略。为了评估ProteomEx在各种哺乳动物组织中的适用性，我们对四种不同的小鼠组织类型（包括脑，肝，乳腺癌和肺）进行了ProteomEx（图3A和补充图8）。由于ProteomEx采用了水凝胶合成物并优化了组织膨胀前未使用过的均相化处理，因此我们首先使用非刚性配准方法定量了基于水凝胶的组织膨胀的各向同性，就像之前proExM-MS方法所做的那样。各向同性膨胀是将蛋白质组空间分布精确映射到预膨胀组织形态的关键。我们计算了长度尺度为1500 μm的组织膨胀后特征测量的均方根(RMS)长度测量误差，发现脑、肝、乳腺癌和肺组织样本的RMS误差分别约为测量距离的8%、10%、8%和10%(图3B和补充图8)。接下来，我们使用DDA-MS处理约5 nL体积的每种组织类型，鉴定出脑、肝、肺、乳腺和乳腺组织的24436/3540、14298/2606、9623/2356种肽/蛋白。为了探索蛋白质组学特征与可视化（通过免疫组织化学和小分子染料染色）的细胞和亚细胞特征相关联的可能性，我们使用DAPI和Aβ抗体对AD小鼠脑切片进行染色，使用ProteomEx对其进行成像和处理。对于2.52 nL的免疫染色组织，我们在三次重复中鉴定了约7000个肽段并对应约2000种蛋白，这证明了ProteomEx与免疫组织化学的相容性(补充图9)。ProteomEx可以很容易地应用于不同的哺乳动物组织类型，并与抗体染色样本兼容。
为了探索ProteomEx的横向空间分辨率和组织体积的极限，我们将脑组织切片的线性尺寸扩大了8倍（体积扩大了512倍），并穿刺出直径为1 mm的组织-水凝胶复合体（对应于膨胀前的125 μm），用于蛋白质组学分析（补充图10）。穿刺组织预膨胀体积为0.37 nL，约相当于160个细胞（使用BNID 100434计算）。在PulseDIA模式分析的每个样本中，我们平均鉴定和定量了超过3000个肽和约1000种蛋白质（图3E）。
3. 正常和致病脑组织的亚区精度的蛋白质组分析
在证明ProteomEx能够在数百微米横向分辨率下对亚纳升体积的组织进行直接的蛋白质组学分析后，我们应用该技术来表征患有和没有AD的小鼠大脑的蛋白质组学异质性。我们使用了两个年龄组的APP/PS1 AD小鼠模型和野生型（WT）小鼠，主要关注作为AD病理最主要区域之一的海马（图4A）。考马斯染色的膨胀脑组织具有明显的解剖标志，可以通过肉眼精确定位感兴趣的子区域，不需要任何成像系统的协助。从每只小鼠大脑中，我们使用使用LEF约为6的ProteomEx，解剖了主要视觉区域的多个亚区（膨胀前直径约330μm），包括：初级视皮层（V1）、海马CA1区（CA1）、海马CA3区（CA3）、齿状回（DG）和内侧膝状复合体（MGC）（图4A）。在组织膨胀后，使用2 mm活检穿刺器进行手动微量采样，从而实现对亚区的选择性和可重复的微解剖。我们之所以选择这个样本量，是因为它足以选择性地解剖大脑子区域，并且基于我们之前的结果，提供了足够深度的蛋白质组识别（图2G、H）。为了验证每个解剖样本的人工微量采样精度，在解剖前后对膨胀的组织进行成像。这些图像使用Allen研究所的大脑图谱进行注册和注释。总的来说，我们从12只小鼠解剖了144个水凝胶样本，并使用优化的凝胶消化方案并行处理它们。采用timsTOF Pro质谱联用仪通过PulseDIA-MS共鉴定出106892个肽前体，51203个肽及6233种蛋白质。在方法和补充图11中描述的质量控制分析之后，对122个样品中定量的6215种独特蛋白质进行下游数据分析。
从整体来看，所有122个样本在t分布随机近邻嵌入（t-SNE）图中都能很好地按年龄（老年/青年）进行分辨（图4B），但不同的基因型（AD/WT）只能在老年小鼠中识别。正如基于AD小鼠基因型所预期的，老年组的脑组织可以通过基因型很好地区分，但对于两种差异表达蛋白（DEPs）APP和PSEN1，青年组的脑组织没有显著差异（图4C）。由于蛋白质组学变化在老年组中更为明显，我们将重点放在老年组，以进行进一步的生物信息学分析。在老年组中，AD小鼠脑中的蛋白质组学在不同脑区或亚区中变化。在脑区水平，海马中有73个DEP，皮质中只有6个，MGC中只有1个（图4C）。这些发现与先前的研究报道一致，即AD的主要病变发生在海马。突触融合蛋白结合蛋白2（STXBP2）、载脂蛋白E（APOE）和聚集素（CLU）在皮质和海马中是重叠DEPs，但在MGC中不是。据之前的报道，APOE和CLU与AD放入进展相关（图4D）。就STXBP2而言，只有少数研究发现其在大脑中的表达，然而，没有文献数据报道其与AD的关联。我们的研究揭示了STXBP2潜在参与AD。海马蛋白组的分区变化也显著。CA1改变最多，有198个DEP；其次是CA3，有19个DEP；而DG没有明显变化（图4C），说明AD病变的变化并不是在整个海马中扩散，而是在海马、CA1和CA3的亚区。APOE、STXBP2以及富含脯氨酸蛋白7（PRR7）和囊泡相关膜蛋白1（VAMP1）在CA1和CA3中发生改变，但在DG亚区没有改变（图4D）。更重要的是，STXBP2和APOE是多个区域中常见的DEP，这再次证明了STXBP2的关键作用（图4D）。PRR7和VAMP1仅在CA1和CA3中有差异表达（补充图11C）。这些结果表明ProteomEx工作流程能够有效地研究AD的病理异质性。我们进一步在空间蛋白质组学图中显示了STXBP2在每个穿刺中的蛋白表达（图4E和补充图11D）。STXBP2在AD组几乎无表达，但在WT组高表达。在WT组中，STXBP2在皮层V1和MGC中表达量较高，而在海马亚区表达量相对较低。由于老年AD小鼠CA1的改变最大，接下来我们重点研究CA1的通路和功能改变。通过Ingenuity Pathway Analysis（IPA）和Metascape数据库富集了192个DEP。图4F显示了前10个富集通路和参与通路的蛋白，以及通路与蛋白的关系。最重要的负通路是Rho家族GTPases的信号通路，它已被证明将细胞外信号转导到肌动蛋白细胞骨架，以改变轴突的生长和生长锥的运动性。此外，一些蛋白质同时参与多种信号通路，例如GNAI3，G蛋白偶联受体（GPCRs）的传感器。它参与RHOGDI信号通路，即Rho家族GTPases信号通路和阿片信号通路。为了进一步探索生物过程和蛋白-蛋白相互作用，通过MCODE算法，在补充图11E中显示了前三个显著富集的簇。STXBP2和VAMP1作为海马区重叠蛋白，在轴突导向、神经系统发育和发育生物学中发挥着重要作用。接下来，我们通过比较同一组内海马三个亚区的蛋白表达，来探索海马的空间异质性。老年AD组（5个DEPs）的差异远低于其他三组（约40个DEPs；补充图11F），说明空间异质性部分减弱。然后，我们计算了三个亚区每两个样本之间的Pearson相关系数，并将结果显示在无监督的层次聚类热图中。无论基因型或年龄，来自同一亚区的大多数样本都聚集在一起（图4G）。DG样品蛋白表达水平一致性较高，各组间差异较小。在CA3区域，分析的样本可以根据蛋白表达进一步分为两个聚类，这需要在未来进行验证。在CA1的聚类中，来自老年小鼠的样本与来自青年小鼠的样本被很好地分开。以上数据表明ProteomEx可以作为研究空间蛋白质组学的有力工具。
讨论
在本研究中，我们开发并验证了一种在100微米横向分辨率下对亚纳升体积的生物组织进行有效的空间蛋白质组学分析的方法。ProteomEx方法结合了通过包埋在可膨胀水凝胶中标本的放大和基于MS的多肽分析，这些多肽是通过优化的凝胶内消化从组织-水凝胶复合体的显微解剖块中提取的。ProteomEx协议，包括组织膨胀、可视化、显微解剖和肽提取，是强大的、廉价的、易于使用的，可以很容易地使用市售试剂和普通用品并部署在一个常规的实验室。优化的凝胶内消化过程提供了高效肽回收兼容任何MS蛋白质组学工作流程。从固定组织开始，总时间约58 h；然而，操作时间只有5小时，最长的步骤，包括组织膨胀和凝胶内消化，可以同时对多个样品进行。使用ProteomEx进行蛋白质分析的深度，仅比使用常用的大块组织制备方法低约10%，而它不会导致包括生物标记物在内的重要生物学信息的大量损失，并且具有几乎相同的亚细胞定位分布（图2F和补充图4）。总的来说，ProtomEx使定量蛋白质鉴定几乎与常用的样品处理方法没有区别。
我们证明，使用手动显微解剖，我们可以有效且可重复地实现约160μm的横向分辨率，这相当于大约262个细胞或0.61 nL组织体积的膨胀。这种横向分辨率与通常使用最先进的技术（如LCM与自下而上蛋白质组学结合使用）实现的分辨率相当。另一方面，ProteomEx与基于液滴萃取表面分析（LESA）的其他微量采样方法相比，提供了至少高出两倍的横向分辨率。我们还证明了通过将样品在线性尺寸上扩大8倍来实现约125μm后期分辨率（或约1 mm的膨胀组织）的可能性（图3E和补充图10）；然而由于手工处理小的透明凝胶样品的困难（肉眼很难看到），我们没有超过这个分辨率。通过使用机器人技术或微流体技术处理亚毫米凝胶片，可以进一步提高ProteomEx的空间分辨率。还应该注意的是，在宏观尺度（>1000 μm）上观察到的放大样品的畸变，比报道的在微观尺度（<100μm）上基于ExM的超分辨率成像方法高约2-4倍，因此在绘制组织形态上的蛋白质图谱时也应考虑到这一点。
除了显微解剖，从微量样品中提取肽是空间解析蛋白质组学的另一个挑战。到目前为止，单管微量样品纳米液滴处理（nanoPOTs）是从纳升和亚纳升体积样品中回收肽的最有效方法之一。与nanoPOTs技术相比，ProteomEx在约1nl体积的组织中产生了相似数量的蛋白质鉴定，尽管亚纳升体积的蛋白质分析深度较低（补充表4，补充图12）。基于文献数据，我们还比较了ProteomEx与其他肽回收方法（包括柱内胰蛋白酶消化系统、固定化酶反应器和LESA）对微量样品的肽和蛋白质鉴定（补充表4，补充图12）。由于对特殊设备和基础设施的要求较低，与基于LCM和LESA的方法相比，ProteomEx是一种更易于使用的空间分辨率蛋白质组学技术，LCM和LESA需要昂贵而复杂的硬件，包括LCM系统、纳米井芯片和机器人微流体设置。然而，应该指出的是，LCM比ProteomEx具有更高的空间分辨率，能够切割任意形状。ProteomEx的实用性使我们能够从多个大脑样本中对大脑亚区进行大规模的蛋白质组学分析，并确定与AD相关的差异表达蛋白。作为原理验证应用，我们能够从固定的大脑切片开始，在58小时内绘制来自12只小鼠的144个水凝胶微样本的蛋白质组。对ProteomEx从这些样本中制备的多肽进行PulseDIA分析，使我们能够在大脑亚区中识别多个DEP。
当这篇稿件正在准备中时，Drelich等人报道了空间分辨蛋白质组学的概念上类似的方法，我们简称为proExM-MS。尽管proExM-MS和ProteomEx共享基于proExM的相同的样品放大方法，但它们在对其适用性至关重要的几个方面存在差异。首先，使用的水凝胶具有不同的膨胀系数。proExM-MS的膨胀系数仅为3倍，比ProteomEx的膨胀系数低2.7倍。相应地，ProteomEx提供了更高的微量采样横向分辨率，达到160 μm（手动解剖），而proExM-MS则约为328 μm。空间分辨率的提升扩展了ProteomEx的适用性，因为它与生物组织异质性的分析更具生物学相关性。例如，约100 μm分辨率更适合分析功能性组织单位（FTU），例如肾小球、结肠隐窝、人肺血管（通常限制在100 μm大小）。此外，Pieowski等人证明，100 μm分辨率足以表征小鼠Wnt5a缺失子宫组织中的区域特异性生物活性和独特的组织微环境。第二，蛋白质锚定是用不同的NHS酯衍生物进行的，这可能可以解释肽产量的差异。之前我们证明，丙烯酰基-X用作proExM-MS中的化学锚，在中性pH和室温下处理的脑组织中渗透深度有限。与丙烯酰基-X相比，ProteomEx中使用的N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯化学锚更具化学稳定性，且价格更实惠，因此使ProteomEx成为更易于使用和用户友好的技术。此外，我们将ProteomEx的适用性扩展到多种哺乳动物组织和组织染色方法，包括免疫组织化学和小分子比色染料。比色染色尤其重要。所有组织样本在膨胀后都变得透明，以至于肉眼很难或几乎不可能看到组织的轮廓和特征，例如，将未染色的2.3倍膨胀组织与考马斯染色后6-8倍膨胀组织进行比较（补充图3、9、10）。因此，当需要根据形态学特征精确定位特定区域时，不染色是不可能进行精确的人工显微解剖的。此外，染色可以确认各向同性膨胀，并在组织形态上绘制蛋白质组图谱。ProteomEx与免疫染色和小分子荧光染料（如DAPI）的兼容性，开启了将超分辨率细胞和亚细胞形态与深度蛋白质组分析相关联的前所未有的能力。
ProteomEx技术为亚纳升体积的固定组织的、空间分辨的基于MS的蛋白质组学分析提供了一种实用而有效的替代方法，否则只能使用LCM等复杂的设备来实现。由于ProteomEx类似于蛋白质保留膨胀显微镜，它可以与细胞结构的超分辨率显微镜以及DNA和RNA荧光原位杂交相结合，从而实现空间分辨率的多组学方法。因此，ProteomEx是实现高分辨率蛋白质组学和深度序列覆盖的潜在技术。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9712279/
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